新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

• 作者: 关景玉 唐颖 廖青 段有文 赤仁杰 陈晓春
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 骨形态发生蛋白2基因 反转录病毒 成骨细胞 四甲基偶氮唑盐 蛋白表达
• 年，卷（期）: 2010,（7）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 1227-1230
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 3689字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.07.020

摘要

背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道.目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用.方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒Sall和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×10~8pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P＞0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达.结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	陈晓春		10	42	4.0	6.0
2	关景玉		6	39	2.0	6.0
3	段有文		4	49	3.0	4.0
4	赤仁杰		11	55	4.0	7.0
5	唐颖		12	37	3.0	6.0
6	廖青		4	24	1.0	4.0