不同表达条件对Eimeria tenella丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响

• 作者: 余劲术 吕敏娜 吴彩艳 孙铭飞 蔡建平 袁建丰 覃宗华 谢明权
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 柔嫩艾美耳球虫 丙二酰单酰辅酶A ACP转移酶 表达载体 酶活性
• 年，卷（期）: 2010,（9）
• 页码范围: 1158-1165
• 分类号: S852.723|Q786
• 字数: 6085字
• 语种: 中文

摘要

为探讨不同原核表达载体、不同表达温度对重组表达Eimeria tenella丙二酸单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响,以生物信息学技术预测的E.tenellaⅡ型脂肪酸合成代谢途径中的丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶(EtMCAT)编序列为基础,分别设计引物扩增完整ORF,采取截除信号肽而保留转导肽以及切除信号肽和转导肽的不同策略,选择pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa 3种不同表达载体分别构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)后,在不同条件下诱导表达,利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性,以评价不同表达策略对表达效果和表达产物活性的影响.表达水平和酶活性分析结果显示,惟切除信号肽和转导肽后的功能蛋白编码区能表达,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat体系的可溶性表达量高于Rosseta(DE3)/pET-32a(+)mcat,但二者表达产物的酶活性相似,且均随着诱导温度的降低其可溶性蛋白表达量增加.但Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat体系仅能表达不溶性蛋白,且复性后无酶活性,改变诱导温度对表达效果无明显影响.结果表明不同表达载体和诱导温度对大肠杆菌所表达EtMCAT的活性及其表达形式有显著影响,其中融合标签和表达温度可能是主要的影响因素,包涵体表达的重组酶即使复性处理仍难达到酶活性分析的要求.