分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FV Ⅲ基因

• 作者: 刘泽隆 屈慧鸽 朱甫祥 杨树德 缪静 迟晓艳
• 来源期刊: 科学通报
• 关键词: 凝血VⅢ因子 分泌 突变重链 蛋白内含子 蛋白质剪接
• 年，卷（期）: 2010,（33）
• 所属期刊栏目: 论文
• 页码范围: 3199-3204
• 页数: 6页
• 语种: 中文
• DOI: 10.1007/s11434-010-4244-7

摘要

在甲型血友病基因治疗中,其疗效受FV Ⅲ的低分泌性和较大的FV Ⅲ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响.研究表明,重链的分泌低下是导致FV Ⅲ分泌低效性的主要原因.我们最近的研究表明,应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FV Ⅲ(BDD-FV Ⅲ)基因,通过表达后重链和轻链的共价连接,轻链可顺式促进剪接BDD-FV Ⅲ的分泌,但重链分泌的低下影响分泌的水平.本文将具有促进FV Ⅲ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FV Ⅲ的重链,通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FV Ⅲ基因,观察了重链和剪接全长FV Ⅲ的分泌和生物活性的变化.构建了一对融合Ssp DnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体,瞬时共转染培养的COS-7细胞,Western blotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FV Ⅲ蛋白表达;突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11)ng/mL,明显高于野生型重链的分泌量;与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13)ng/mL,培养上清中分泌的剪接FV Ⅲ量和活性分别为(86±14)ng/mL和(0.61±0.08)IU/mL,明显高于断裂的野生型FV Ⅲ共转基因.另外,转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FV Ⅲ蛋白和生物活性,且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清.结果表明,重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FV Ⅲ基因的功效,为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FV Ⅲ基因提供了实验依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	屈慧鸽		72	330	10.0	15.0
2	刘泽隆		49	99	7.0	9.0
3	缪静		57	250	10.0	14.0
4	朱甫祥		38	21	3.0	4.0
5	迟晓艳		47	54	4.0	6.0
6	杨树德		27	167	6.0	12.0