反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

• 作者: 刘君 卫小春 向川 林树忠
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 反转录病毒 转化生长因子β_1 转染 基因表达 软骨细胞 ELISA 软骨组织工程
• 年，卷（期）: 2010,（2）
• 所属期刊栏目: 研究与报告
• 页码范围: 214-217
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 5551字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.02.006

摘要

背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤.目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β_1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响.方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞.载体经PLNCX_2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed_2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX_2-RFP.转化生长因子β_1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX_2-RFP连接,构建PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度.将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX_2组、转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化.收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β_1表达.结果与结论:重组基因PLNCX_2-TGFβ_1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ_1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×10~6CFU.稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功.持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃.转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX_2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX_2组间差异无显著性意义.对照组与转染PLNCX_2组均无转化生长因子β_1表达,转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组转化生长因子β_1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L.提示反转录病毒载体PLNCX_2介导的人转化生长因子β_1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卫小春	山西医科大学第二医院骨科	256	1901	21.0	31.0
2	向川	山西医科大学第二医院骨科	60	354	9.0	16.0
3	林树忠	太原市中心医院骨科	8	54	4.0	7.0
4	刘君	太原市中心医院骨科	12	31	3.0	5.0