携带低氧诱导因子1αmu 和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体构建及其在HEK293A细胞中的表达

• 作者: 刘丹平 张正 李谌 胡亮
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 低氧诱导因子1α 基因突变 腺病毒载体 绿色荧光蛋白 HEK293A细胞
• 年，卷（期）: 2010,（46）
• 页码范围: 8594-8599
• 分类号: R318
• 字数: 5898字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.46.011

摘要

背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道.目的:实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein, hrGFP)的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达.方法:利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点Not Ⅰ和PuvⅠ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中.经测序鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况.结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除.经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功.荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘丹平	辽宁医学院附属第一医院骨关节外科	61	259	9.0	13.0
2	李谌	辽宁医学院附属第一医院骨关节外科	22	51	4.0	6.0
3	张正	辽宁医学院附属第一医院骨关节外科	8	9	2.0	2.0
4	胡亮	辽宁医学院附属第一医院骨关节外科	5	11	2.0	3.0