人膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定

• 作者: 刘龙丁 柯昌兴 毕城伟 王剑松 胡明宇 詹辉 陈慧诚 颜汝平
• 来源期刊: 中国全科医学
• 关键词: 纤溶酶原 Kringle 5基因 融合蛋白 基因
• 年，卷（期）: 2010,（15）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1656-1659
• 分类号: R730.5|R737.14
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-9572.2010.15.019

摘要

目的 构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle 5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性. 方法 从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白.带谷胱甘肽(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白,CellTiter 96 AQueous细胞增殖检测法(MTS)检测K5对ECV304增殖影响.结果 PCR扩增得到282 bp片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下工程菌表达了特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12 kD的K5蛋白;K5蛋白能特异性抑制ECV304增殖,抑制率最高蛋白浓度为5 ng/L. 结论 含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量多且易纯化,为包括肿瘤在内的病理性血管增生疾病抗血管生成药物开发做了积极的尝试.