基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

• 作者: 刘雪荣 吴小兵 尉迟捷 柳云帆 沈炜 王刚 田文洪 董小岩 郑刚 阮力 陆月
• 来源期刊: 病毒学报
• 学科: 医学
• 关键词: λ-Red重组酶 PCR打靶 腺病毒 Ⅳa2
• 年，卷（期）: 2011,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 257-264
• 页数: 8页
• 分类号: Q782|R373.1
• 语种: 中文

摘要

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1 104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒.首先构建PcR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-△Ⅳa2(1104).酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3端的1 104bp片段.用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2.将pFG140-△Ⅳa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5△Ⅳa2(1104).Western Blot的结果表明,Ad5△Ⅳa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达.本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒.