三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

• 作者: 刘智俊 吴旭干 张艳 成永旭 杨帆
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 三疣梭子蟹 卵黄磷蛋白 纯化 酶联免疫吸附法 优化参数
• 年，卷（期）: 2011,（8）
• 页码范围: 1146-1157
• 分类号: Q956|S917.4
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1231.2011.17406

摘要

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白( vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法.结果表明:(1) SDS-PAGE显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2)样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8h,一抗和二抗反应时间分别为2h和1h,显色时间为20 min;(3)该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+ +0.399 1(R2=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD450值,工作范围为200 ～900 ng/mL; (4)应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59％和3.10％,重复性良好.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨帆	浙江大学生命科学学院	55	118	6.0	7.0
2	成永旭	上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点试验室	75	457	11.0	17.0
3	吴旭干	上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点试验室	65	396	10.0	16.0
4	刘智俊	上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点试验室	7	89	5.0	7.0
5	张艳	上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点试验室	2	14	2.0	2.0