shRNA沉默ROCK1和ROCK2表达对缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

• 作者: 丁浩 吴清华 孙国芳 李菊香 洪葵 程晓曙 董家龙
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Rho相关的卷曲蛋白激酶 心肌细胞 shRNA 缺氧 细胞凋亡
• 年，卷（期）: 2011,（12）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 2307-2312
• 分类号: R363
• 字数: 3558字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.013

摘要

目的:探讨Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1)和ROCK2在缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡中的作用.方法:原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定.将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染细胞,48 h后给予缺氧6 h处理.实验分为5组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+阴性对照shRNA组;(4)缺氧+ROCK1-shRNA组;(5)缺氧+ROCK2-shRNA组.用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;用MTT检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;用Western blotting检测ROCK1和ROCK2的表达,并检测caspase-3和p-PI3K的表达情况.结果:鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功.缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01).全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.01).MTT检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低(P<0.05),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05).流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01).Western blotting检测发现,ROCK1-shRNA的转染能降低ROCK1的表达(P<0.05),ROCK2-shRNA的转染能降低ROCK2的表达(P<0.01);缺氧能导致caspase-3表达升高(P<0.05)、p-PI3K表达降低(P<0.01),ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01).结论:ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞凋亡,其机制与抑制caspase-3活化和增强p-PI3K的表达有关.