ROX参比荧光在实时荧光定量RT-PCR检测Nrf2mRNA中的应用

• 作者: 张春兵 杨学文 王佳 高峰
• 来源期刊: 中华检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: NF-E2相关因子2 逆转录聚合酶链反应 琥珀酰亚胺类 若丹明类
• 年，卷（期）: 2011,（8）
• 所属期刊栏目: 实验室质量管理
• 页码范围: 742-747
• 分类号: R735.2
• 字数: 4980字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.08.016

摘要

目的 建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法,评价ROX参比荧光在其分析中的归一化校正作用.方法 采用Taq Man探针法构建大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;取大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR产物,经凝胶电泳和测序鉴定反应特异性;取PCR标准品10个浓度梯度(2.0×109～2.0×100)各1份进行实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的标准曲线的线性范围的变化;取高、中、低值重组质粒样本各1份进行批内重复20次和批间连续20次实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的批内、批间重复性差异.结果 成功建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR扩增片段与预期122 bp相符,测序结果扩增片段序列正确,PCR特异性好;标准品PCR扩增结果的标准曲线线性范围未经ROX参比荧光校正为2.0×109～2.0×102拷贝/μl(R2＞0.99),校正后为2.0×109～2.0×100拷贝/μl(R2＞0.99),校正后线性范围变宽100倍.高、中、低值样本重复性分析结果显示未经ROX参比荧光校正批内Ct变异系数(CV)为4.1%、2.7%、2.1%,批间CV为4.3%、3.0%、2.4%,校正后批内CV为0.7%、0.5%、0.4%,批间CV为1.0%、0.8%、0.7%,ROX参比荧光校正后样本Ct离散程度均低于未校正组,批内、批间的高值、中值浓度样本(高值组批内和批间t值分别为4.843、2.566,中值组批内和批间t值分别为4.293、4.423,P均＜0.05),但低浓度组的Ct离散度的差异无统计学意义(低值组批内和批间t值分别为0.753、1.279,P均＞0.05).结论 在构建大鼠Nrf2实时荧光定量RT-PCR检测方法中,加入ROX参比荧光,可加宽PCR标准曲线的线性范围,提高检测重复性,为准确分析大鼠模型Nrf2 mRNA表达水平奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王佳	江苏省中医院检验科	15	52	4.0	6.0
2	张春兵	江苏省中医院检验科	23	137	7.0	10.0
3	高峰	江苏省中医院检验科	28	81	6.0	8.0
4	杨学文	江苏省中医院检验科	31	182	8.0	12.0