EHEC O157:H7二重PCR的建立及应用

• 作者: 何孔旺 俞正玉 倪艳秀 叶青 吕立新 周俊明 姜平 张雪寒 李丽 李彬 栾晓婷 温立斌 王小敏 茅爱华 赵攀登 郭容利
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 生物学
• 关键词: O157 H7 二重PCR 方法建立 细菌分离 样品检测
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 页码范围: 59-66
• 分类号: Q78
• 字数: 4785字
• 语种: 中文

摘要

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法.根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析.运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定.成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5:1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp.检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g.检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC.只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带.从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性；药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性；rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3％～99.2％之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6％～100％之间；4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱.以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率.