人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

• 作者: 刘凯胜 刘忠 张嘉萱 张庶民 王一飞 王绍祥
• 来源期刊: 生物技术通报
• 学科: 生物学
• 关键词: 热休克蛋白90AB1 (Hsp90β) 克隆 原核表达 中试发酵 纯化
• 年，卷（期）: 2011,（10）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 120-125,134
• 分类号: Q78
• 字数: 5733字
• 语种: 中文

摘要

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13％.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98％.