pDC315-SPA-mCLCA3载体的构建及其在气道上皮细胞系的靶向表达分析

• 作者: 何丽 张惠兰 张波 梅丽 熊维宁 赵建平 马经平
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肺表面活性物质相关蛋白A启动子 CLCA3蛋白,小鼠 气道上皮细胞 靶向表达
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 所属期刊栏目: 实验技术
• 页码范围: 1240-1244
• 分类号: R363
• 字数: 3467字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2011.06.037

摘要

目的:构建腺病毒穿梭质粒(pDC315)-肺表面活性蛋白A基因启动子(SPA)-小鼠钙激活氯通道3(mCLCA3)融合基因表达载体,分析其在气道上皮细胞系的靶向表达.方法:PCR法从 PGL-SPA 和 pCR-Blunt II-TOPO载体中克隆全长2 948 bp的SPA-mCLCA3基因序列并将其亚克隆入pDC315-EGFP 载体,构建pDC315-SPA-mCLCA3靶向表达载体.测序鉴定正确后分别转染气道上皮细胞系(H441细胞)和非气道上皮细胞系(HEK293细胞).每种细胞分pDC315-EGFP组(EGFP阳性,mCLCA3阴性)和 pDC315-SPA-mCLCA3组(mCLCA3阳性),分析mCLCA3在不同上皮细胞的表达水平.结果:测序结果证实成功构建含有气道上皮细胞特异性启动子SPA的mCLCA3重组质粒.靶向表达分析表明mCLCA3 mRNA在高表达SPA的H441细胞中表达显著高于其在HEK293细胞的表达(P<0.05);免疫细胞化学表明H441细胞pDC315-SPA-mCLCA3组中mCLCA3蛋白表达阳性而pDC315-EGFP组表达阴性,HEK293细胞两种质粒转染组mCLCA3蛋白均阴性.结论:成功构建气道上皮细胞靶向表达mCLCA3基因的重组腺病毒穿梭载体pDC315-SPA-mCLCA3,为后续构建腺病毒靶向载体Ad -SPA-mCLCA3及研究mCLCA3在气道上皮缺陷中的作用提供实验基础.