AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

• 作者: 卢亦成 崔勇 王君玉 王麒 胡国汉 陈静 骆纯
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 生物学
• 关键词: 丝/苏氨酸蛋白激酶2 RNA干扰 短发夹结构RNA 慢病毒载体
• 年，卷（期）: 2011,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1413-1416
• 分类号: Q75|Q78
• 语种: 中文

摘要

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体.应用 shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot 鉴定 AKT2基因在U87细胞中的下调作用.结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致.荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59x 10<'7>TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%.PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%.Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用.结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件.