心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG蛋白表达载体的构建及鉴定

• 作者: 张娜 李杰 栾波 梁卓 段岩 闫承慧 霍煜 韩雅玲
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 医学
• 关键词: α-MHC 启动子 CREG 质粒构建 转染 小鼠原代心肌细胞
• 年，卷（期）: 2011,（19）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 3610-3614
• 分类号: Q95-3|R54|Q75|Q78
• 语种: 中文

摘要

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体.绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体.方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-Nl;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经AseI和NheI双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定.用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达.结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达.结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础.