大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

• 作者: 刘成 方岩 杨凯 王萍 田学愎 田玉科
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 硫酸软骨素蛋白多糖 RNA干扰 慢病毒 感染 细胞
• 年，卷（期）: 2011,（15）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2735-2738
• 分类号: R318
• 字数: 4097字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2011.15.018

摘要

背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达.目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率.方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩.采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度.将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达.结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi.包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L.Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05).结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王萍	华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室	80	370	12.0	16.0
2	杨凯	华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室	50	306	9.0	15.0
3	田学愎	华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室	29	209	7.0	13.0
4	刘成	华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室	17	150	5.0	12.0
5	方岩	华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室	5	11	3.0	3.0