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摘要:
目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物(HYI)与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法(1)以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增;Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1(1 ~447 bp)、HYI-2(247 ~447 bp)、HYI-3(1 ~279 bp)、HYI-4(247 ~654 bp)片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.(2)采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基(简称四缺培养基)上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基(简称二缺培养基)上,培养3~6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果(1)克隆出的P311片段与Genbank中P311(序号hsu36189)序列一致.与Genbank中HYI(序号AY775560)序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.(2)计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.(3)HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.(4)除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,其中HYI-2(α螺旋结构最少)、HYI-3杂交组长出菌落较少.(5)除生长在二缺培养基上的阴性对照组菌落和生长在四缺培养基上的HYI-2杂交组菌落未见β半乳糖苷酶表达外,其他在四缺培养基上长出的各组菌落均有β半乳糖苷酶表达. 结论 HYI与P311蛋白可能以α螺旋结构紧密结合,在增生性瘢痕Fb向肌成纤维细胞转分化过程中发挥重要作用.
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文献信息
篇名 增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析
来源期刊 中华烧伤杂志 学科 医学
关键词 瘢痕 成纤维细胞 双杂交系统技术 羟基丙酮酸异构酶同系物 结合结构域 P311
年,卷(期) 2012,(1) 所属期刊栏目 论著
研究方向 页码范围 60-64
页数 分类号 R619.6
字数 4026字 语种 中文
DOI 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2012.01.016
五维指标
作者信息
序号 姓名 单位 发文数 被引次数 H指数 G指数
1 汪静 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 49 263 9.0 14.0
2 刘洋 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 189 780 14.0 20.0
3 马兵 成都医学院附属医院烧伤整形科 18 64 4.0 7.0
4 赵云 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 77 751 14.0 24.0
5 张克 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 3 2 1.0 1.0
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研究主题发展历程
节点文献
瘢痕
成纤维细胞
双杂交系统技术
羟基丙酮酸异构酶同系物
结合结构域
P311
研究起点
研究来源
研究分支
研究去脉
引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
中华烧伤杂志
月刊
1009-2587
50-1120/R
大16开
重庆市沙坪坝区高滩岩正街
78-131
1985
chi
出版文献量(篇)
4698
总下载数(次)
6
相关基金
国家自然科学基金
英文译名:the National Natural Science Foundation of China
官方网址:http://www.nsfc.gov.cn/
项目类型:青年科学基金项目(面上项目)
学科类型:数理科学
论文1v1指导