猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

• 作者: 云彦 井勇 史芸安 吴苏君 李伟 杨文琳 赵贵民 雷安民
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: H1foo基因 5'RACE 体外转录 显微注射 猪卵母细胞
• 年，卷（期）: 2012,（1）
• 所属期刊栏目: 研究资源
• 页码范围: 85-93
• 分类号: S828
• 字数: 6285字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.01.012

摘要

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体；用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位；最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％；真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核；体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体；体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.