斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价

• 作者: 喻达辉 曾令兵 陈健光 黄桂菊 龙华
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 斜带石斑鱼 神经坏死病毒 CP基因 shRNA干扰载体
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 页码范围: 343-349
• 分类号: S917|Q785
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1231.2012.27714

摘要

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA( short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链( 19 nt) -环(4 nt) -负链(19 nt)].化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA -124、pshRNA-896和pshRNA-NNV.然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化.结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47％、68％、51％.3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好.Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60％、96％和55％,与对照组相比差异显著(P＜0.05).研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础.