徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备

• 作者: 张亚妮 曹文广 朱才业 李伟 李碧春 杜立新 阴彦辉 韦光辉
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 徐淮山羊 心脏型脂肪酸结合蛋白 真核表达 荧光蛋白 转基因鼠
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 所属期刊栏目: 遗传繁育
• 页码范围: 684-692
• 分类号: S827|S813.3
• 字数: 6931字
• 语种: 中文

摘要

旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能.通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性.采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP.脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48 h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达.利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况.结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402 bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1.徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89％、76％、85％、84％、93％、91％、70％,氨基酸序列同源性为90％、79％、88％、97％、95％、94％、72％.成功构建融合表达载体pEGFP- H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达.目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中).通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达.本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的.该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达.