细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

• 作者: 唐刘君 李娟 杨晓明 查欣 汪思应 王晓辉 胡中倩 邢小翠
• 来源期刊: 安徽医学
• 学科: 医学
• 关键词: CDCA3蛋白 RNA干扰 shRNA 载体构建
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 136-140
• 分类号: R346
• 字数: 4195字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-0399.2012.02.003

摘要

目的 设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能.方法 根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Real time RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果 成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平.结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达.成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础.