人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

• 作者: 兰小鹏 宋涛 杨湘越
• 来源期刊: 生物技术通报
• 学科: 医学
• 关键词: 自身抗原 SSA52 克隆 表达 巴斯德毕赤酵母 斑点免疫金渗滤法
• 年，卷（期）: 2012,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 176-180
• 分类号: R392.1
• 字数: 4026字
• 语种: 中文

摘要

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题.通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法.采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化予,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究.结果显示,RT-PCR产物约为1 400bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52 的相对分子质量约52 kD.Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带.DIGFA 与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2％( 120/126),阴性符合率为94.0％( 47/50),总符合率为94.9％( 167/176)；两种方法检测结果无统计学显著差异(P＞0.05).说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	兰小鹏	南京军区福州总医院解放军临床检验医学研究所	103	463	11.0	14.0
2	杨湘越	南京军区福州总医院解放军临床检验医学研究所	50	247	9.0	13.0
3	宋涛	南京军区福州总医院解放军临床检验医学研究所	1	1	1.0	1.0