大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 丁晓然 周伟 周喆 周焕芝 张五星 张智敏 石炳毅 赵学伟
• 来源期刊: 四川医学
• 学科: 医学
• 关键词: 信号转导子及转录激活子3( STAT3) 短发夹RNA(shRNA) 慢病毒载体 RNA干扰(RNAi)
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 基金论文
• 页码范围: 195-198
• 分类号: R78
• 字数: 2371字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-0501.2012.02.002

摘要

目的 在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定.方法 将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量.对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1 TM慢病毒载体系统进行病毒包装.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测.结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳.成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功.转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞.结论 成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础.