人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定★

• 作者: 刘彤 只向成 史玉荣 牛瑞芳 胡凡果
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 乳腺癌 端粒 端粒酶 端粒酶反转录酶 端粒酶活性 小干扰RNA RNA干扰 小发夹RNA 组织构建
• 年，卷（期）: 2012,（50）
• 页码范围: 9357-9363
• 分类号: R318
• 字数: 6382字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.50.009

摘要

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点.RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域. 目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响. 方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(Bam H Ⅰ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞. 结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹 RNA 质粒表达载体,经测序验证无误.将 pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞.经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P <0.01).结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性.