PK-15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用

• 作者: 丛晓燕 吴家强 孙文博 时建立 李俊 杜以军 柳晓 王金宝 邹榕凯
• 来源期刊: 家畜生态学报
• 学科: 农学
• 关键词: qPCR SYBR Green Ⅰ 猪圆环病毒2型 PK-15细胞 α-干扰素
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 科学研究
• 页码范围: 19-24
• 页数: 6页
• 分类号: S811.6
• 字数: 3287字
• 语种: 中文

摘要

为建立一种用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测PK-15细胞α干扰素(α-IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法,通过在猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)抑制α-IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用.根据GenBank中目的基因的序列,利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物.利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T) 15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH 5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验.根据建立的实时qPCR方法,检测PCV2对α-IFN效应因子的抑制效果.对建立的PK-15细胞α-IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析,结果表明Mx1、OAS和内参β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×10(1)～1×10(8) copies/μL的范围分别呈良好的线性关系.PK-15细胞在接种PCV2,并受到α-IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低.本试验建立了PK-15细胞α-IFN效应因子的qPCR检测方法,为在mRNA水平上对PK-15细胞α-IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于PCV2抑制α-IFN发挥效应的信号通路研究中.