HBV DNA定量与基因分型双重分子信标实时PCR方法的建立及初步应用

• 作者: 刘灿 商红艳 杨滨 欧启水 江凌 王炜 陈晓
• 来源期刊: 中华检验医学杂志
• 关键词: 肝炎病毒,乙型 DNA,病毒 基因型 聚合酶链反应
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 333-338
• 页数: 6页
• 字数: 4533字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2013.04.010

摘要

目的 研究建立同时进行HBV DNA定量与基因分型检测的双重分子信标实时PCR法(以下简称“定量与分型PCR法”),并探讨其应用价值.方法 构建B、C基因型重组质粒作为标准品,通过设计B、C基因型特异性引物和分子信标(B、C基因型分子信标5’端分别标记FAM和Hex荧光基团),建立在1个反应体系中同时定量与分型PCR法.然后,用10倍梯度稀释的B、C基因型标准品(103 ～ 1011 kIU/L)评价其检测线性范围和灵敏度；用丙型肝炎病毒感染者、单纯疱疹病毒感染者、人类乳头瘤病毒感染者、健康志愿者血清各5份评价其检测特异性；用高、中、低3份不同浓度的B、C基因型质粒标准品(108、106、104 kIU/L)进行同批次和不同批次各10次重复检测,分别计算批内及批间Ct值的变异系数(CV)评价其检测重复性.然后,以湖南圣湘生物科技有限公司HBV核酸定量测定试剂盒为HBV DNA定量参照方法,申友公司HBV基因分型试剂盒为HBV基因分型参照方法,同定量与分型PCR法平行检测132例HBV感染者血清标本,评价自建定量和分型PCR法的准确性.最后,将132例HBV感染者分为无症状携带组(21例)、慢性乙型肝炎组(77例)、肝硬化组(25例)、肝癌组(9例),分析评价基因型、疾病进展的不同阶段与DNA载量间的相关性.结果 用自建定量与分型PCR法检测B、C基因型的灵敏度均为103 kIU/L;线性范围均为103 ～ 1011 kIU/L;检测B基因型批内CV为1.51％ ～ 1.80％,批间CV为2.11％ ～3.03％,检测C基因型批内CV为1.79％～1.95％,批间CV为2.53％ ～2.91％；对其他病毒感染者和健康志愿者血清检测结果均为阴性.定量与分型PCR法检测132例HBV感染者的基因分型结果与HBV测序分型试剂盒总符合率为90.9％(120/132,Kappa=0.832,P＜0.05)；其DNA定量结果[5.07(3.89 ～6.33) lg kIU/L]与HBV核酸定量测定试剂盒定量结果[5.19(4.15 ～6.32) lg kIU/L]有很好的相关性(R2=0.8477,P＜0.05).此外,定量与分型PCR法检出B基因型69例、C基因型51例、B/C混合基因型12例,DNA载量分别为4.54(3.83 ～6.17)、5.53(4.02 ～6.55)、4.58 (3.68～4.98) lg kIU/L,C基因型感染者DNA水平高于B基因型和B/C混合基因型感染者(Z值分别为-2.195、-2.162,P均＜0.05)；无症状携带组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组DNA载量分别为7.02(6.35 ～7.84)、4.94(4.16～6.25)、4.37(3.50 ～5.17)、3.45 (3.25 ～4.92) lg kIU/L,无症状携带组DNA水平显著高于其他3组(Z值分别为-4.244、-4.568、-3.489,P均＜0.001),慢乙型肝炎组DNA水平与肝硬化和肝癌组比较,差异均有统计学意义(Z值分别为-2.894、-2.413,P均＜0.05),但肝硬化组与肝癌组的差异无统计学意义(Z=-0.995,P=0.335).结论 建立的定量与分型PCR法准确、灵敏、特异,可同时进行HBV DNA的定量和基因分型检测.(中华检验医学杂志,2013,36:333-338

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	江凌	福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室	11	21	4.0	4.0
2	欧启水	福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室	79	341	10.0	13.0
3	刘灿	福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室	18	96	6.0	9.0
4	杨滨	福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室	57	269	10.0	14.0
5	王炜	福建医科大学第一临床医学院	10	25	3.0	3.0
6	商红艳	福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室	5	14	3.0	3.0
7	陈晓	福建医科大学第一临床医学院	5	14	3.0	3.0