慢病毒介导的mTOR敲低肝癌细胞株HepG2的构建及初步功能检测

• 作者: 刘家宏 叶棋浓 吕朝晖 徐小洁 朱建华 符静 肖文华 范忠义 陆菊明
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 RNA干扰 慢病毒
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 467-470
• 页数: 4页
• 分类号: Q78
• 字数: 3057字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.004

摘要

目的：建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）小干扰RNA（siRNA）细胞导入方法，并对mTOR敲低的HepG2肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法：构建了2条不同的人mTOR慢病毒siRNA载体pLenti-H1/mTOR siRNA，与3个包装质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒后感染HepG2细胞；经嘌呤霉素筛选2周后，收集细胞进行Western印迹，检测mTOR敲减效果及其下游基因c-myc、周期蛋白D1（cyclinD1）表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平的变化。结果：RT-PCR和Western印迹结果显示，构建的pLenti-H1/mTOR siRNA能有效抑制mTOR基因的表达，敲低了mTOR蛋白水平，且沉默mTOR后其下游基因c-myc、CyclinD1的表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平降低。结论：构建了慢病毒介导RNA干扰mTOR表达载体，为进一步研究mTOR通路奠定了实验基础。