粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

• 作者: 于波 刘凯 刘莎 叶长芸 徐建国 金东
• 来源期刊: 疾病监测
• 学科: 医学
• 关键词: 粪肠球菌 TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应 d-丙氨酸聚连接酶基因
• 年，卷（期）: 2013,（5）
• 所属期刊栏目: 传染病监测
• 页码范围: 356-359
• 分类号: R515
• 语种: 中文
• DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.5.007

摘要

目的 建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法.方法 根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQPCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性.将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限.制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能.结果 在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线.建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管.通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103cfu/ml.在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99％ ～ 1.84％.结论 本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法.