pIRES 2-BDNF-VEGF 165真核表达载体的构建与鉴定

• 作者: 丰慧根 李卫东 林俊堂 栗炳南
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织构建基础实验 脑源性神经营养因子 血管内皮生长因子165 真核双表达载体 内部核糖体进入位点 转染 双PCR 省级基金
• 年，卷（期）: 2013,（50）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建基础实验
• 页码范围: 8719-8728
• 页数: 10页
• 分类号: R318
• 字数: 1656字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.50.016

摘要

背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。<br>　　目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。<br>　　方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因，然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建为pIRES 2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。<br>　　结果与结论：DNA测序显示，提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES-VEGF 165基因片段，经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	丰慧根	新乡医学院生命科学技术学院	75	167	6.0	8.0
2	林俊堂	新乡医学院生命科学技术学院	61	101	5.0	6.0
3	李卫东	新乡医学院生命科学技术学院	7	2	1.0	1.0
4	栗炳南	新乡医学院生命科学技术学院	4	1	1.0	1.0