低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达

• 作者: 哈小琴 姜东红 张玉 张玉琴 彭俊华 王鲲 董菊子 赵勇 邓芝云
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 生物学
• 关键词: 低氧诱导因子-1α 角质细胞生长因子 基因 腺病毒 构建 表达
• 年，卷（期）: 2013,（32）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 6249-6254
• 分类号: Q78
• 语种: 中文

摘要

目的:构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景.方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1α cDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-lα连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF.然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmneI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF.采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF.检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达.结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高.用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20± 2.92)ng/mL.结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础.