无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

• 作者: 吴灶和 汤菊芬 王培 王蓓 简纪常 蔡佳 鲁义善
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: 吉富罗非鱼 免疫球蛋白M 基因克隆 原核表达 蛋白免疫印迹
• 年，卷（期）: 2014,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 116-123
• 语种: 中文

摘要

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析.sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR) 140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构.预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为536.系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus) sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近.sIgM基因有4个恒定区.将吉富罗非鱼(0.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4h蛋白表达量最大.纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达.