杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan 实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

• 作者: 刘春 吴淑勤 常藕琴 曾伟伟 李凯彬 梁慧丽 王庆 王芳
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 杂交鳢 弹状病毒 G蛋白 TaqMan real-time PCR 检测方法
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 页码范围: 136-142
• 分类号: S941
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1231.2014.48778

摘要

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价.结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84％;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应.应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义.