RIP3基因重组质粒构建及其表达对MCF7细胞死亡方式的影响

• 作者: 佟仲生 徐惠君 贾勇圣 路灿
• 来源期刊: 天津医药
• 关键词: 蛋白质类 蛋白质构象 乳腺肿瘤 质粒 坏死 细胞凋亡 肿瘤坏死因子α 存活率
• 年，卷（期）: 2014,（2）
• 所属期刊栏目: 细胞与分子生物学
• 页码范围: 109-112
• 页数: 4页
• 分类号: R73-3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.02.004

摘要

目的：建立稳定过表达RIP3基因的乳腺癌细胞株，并证实融合蛋白在细胞内的表达、定位及对MCF7细胞死亡方式的影响。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测4种乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中RIP3 mRNA的表达。以正常乳腺上皮细胞MCF10A cDNA为模板，PCR扩增RIP3基因cDNA全长，将合成的RIP3编码区序列，克隆入mCherry载体的N末端，构建重组质粒mCherry-RIP3，对重组质粒进行酶切鉴定及DNA测序。钙法转染293T细胞，收集病毒感染MCF7细胞，杀稻瘟菌素(4 mg/L)维持筛选，构建稳定表达细胞株。Western blot、荧光显微镜等检测目的基因表达效率及蛋白定位。显微镜下观察肿瘤坏死因子（TNF）-α及Caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理下mCherry-RIP3-MCF7细胞的死亡形态及比例。结果 RIP3 mRNA在乳腺癌细胞中普遍低表达。RIP3基因成功克隆入载体。过表达mCherry-RIP3基因的MCF7细胞可见红色荧光蛋白表达，定位于胞质。目的基因RIP3在转染细胞中为过表达。mCherry-RIP3转染后增强MCF7细胞对TNF-α联合Z-VAD-FMK诱导的细胞坏死的敏感性。结论成功构建RIP3基因过表达重组质粒，获得外源性RIP3稳定过表达的乳腺癌MCF7细胞株，mCherry-RIP3定位于胞质，并在TNF-α介导的程序性坏死中起作用。