在长载体中引入定点突变的方法

• 作者: 万海粟 周清华 孟凡荣 陈琛
• 来源期刊: 中国肺癌杂志
• 关键词: 定点突变 长载体 Type IIs类限制性内切酶 桥点引物
• 年，卷（期）: 2014,（7）
• 所属期刊栏目: 技术进展
• 页码范围: 563-568
• 页数: 6页
• 字数: 2762字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.07.12

摘要

背景与目的体外基因定点突变是分子生物学实验的常用方法。然而，虽然目前已经报道了多种基因突变的方法，但对于在长的载体序列中引入突变，一般的方法并不太容易实现。方法本研究在我们前期报告的基因突变方法的基础上，描述了一种简单易操作的可在长序列中引入定点突变的方法。这个方法的基本实验程序是：①确定待突变区域，合成一对均含有Type IIs类限制性内切酶位点载体引物，并合成一对互补的突变单链；②在突变区域之外的合适位置上，选择一个桥点，并合成一对均含有Type IIs类的限制性内切酶位点的桥点引物；③利用载体引物序列和桥点引物序列做PCR反应，以扩增载体序列中突变区域外的序列；④利用相应的Type IIs类的限制性内切酶，对以上扩增产物进行酶切；⑤将酶切产物和两个突变单链复性成的突变双链连接，形成突变载体，并转化进受体菌作克隆鉴定。结果为证明我们所报告的方法的有效性，我们在长的载体中进行了测试，结果显示，不但实验操作简单易行，而且突变效率可达到90%以上。结论我们提供了一种有效的在长载体中进行定点突变的方法。