筛选和转化药用野生稻TAC克隆获得耐旱水稻

• 作者: SHAHID Muhammad Qasim 傅雪琳 刘向东 刘耀光 刘蕊 卢永根 张欢欢 陈志雄
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 药用野生稻(Oryza officinalis Wall.) TAC文库 遗传转化 耐旱性
• 年，卷（期）: 2014,（8）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 1445-1457
• 页数: 13页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.08.001

摘要

【目的】利用分子生物学技术建立一种可有效转移药用野生稻有利基因的方法，为进一步大量开展利用药用野生稻有利基因提供技术基础。【方法】以植物抗性相关转录因子AP2/EREBP和bZIP家族基因保守序列为探针，采用同位素α-32P对探针进行标记，通过Southern 杂交对药用野生稻TAC文库进行第一轮筛选；所获得阳性克隆用地高辛标记的探针进行第二轮筛选；最后利用PCR方法对第二轮筛选所获得的阳性克隆进行验证。通过农杆菌介导法将阳性克隆转入栽培稻品种日本晴，利用TAC载体插入片段两端的抗性标记Hpt和SacB，通过PCR扩增检测和和Southern杂交对转化植株进行鉴定。采用PEG胁迫法和生理指标变化对转基因T2植株的芽期、苗期耐旱性进行鉴定。【结果】第一轮TAC文库筛选共获得1073个阳性克隆，其中，以AP2/EREBP的保守序列为探针筛选出606个、bZIP为探针筛选出467个。对这些阳性克隆进行第二轮筛选，从中共获得147个阳性克隆，其中， AP2/EREBP为探针筛选出95个、bZIP为探针筛选出52个。PCR验证有103个阳性克隆能够扩增出目的片段，分别是利用AP2/EREBP设计的引物筛选出63个克隆和bZIP的40个克隆，阳性克隆得率分别为66.32%和76.92%。通过农杆菌转化，以编号为52D-M16和22D-P2（与AP2/EREBP相关）以及55R-A17、49R-O14和8-A24（与bZIP相关）的克隆转化水稻日本晴均获得转化植株，转化试验结果发现外源插入片段越大则克隆转化的成苗率越低。抗性鉴定、PCR和Southern杂交结果均证明外源片段已转入受体水稻品种日本晴中。芽期抗旱性鉴定表明R12-23、R15-41和R1-83份材料的耐旱性优于受体日本晴，苗期鉴定显示M63-9和R12-23的耐旱性较强。综合认为，R12-23具有较好的耐旱性。【结论】通过构建药用野生稻TAC文库并结合特异克隆筛选和遗传转化方法，可以进行有利基因的转移，结合进一步的育种，有望实现药用野生稻在育种上的利用。