家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析

• 作者: 党晓群 周泽扬 李春峰 李田 林立鹏 潘国庆 龙梦娴
• 来源期刊: 昆虫学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 家蚕微孢子虫 ADP/ATP转运蛋白 原核表达 免疫印迹 亚细胞定位
• 年，卷（期）: 2014,（3）
• 所属期刊栏目: 病理
• 页码范围: 300-307
• 分类号: Q966
• 语种: 中文

摘要

[目的]家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量.本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础.[方法]通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N.bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入Bglll和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)标签的表达载体pQE40中,然后利用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a(+)载体中进行诱导表达.通过SDSPAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测.[结果]家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列(GenBank登录号为EOB13854.1)全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35.具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点.与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30％.系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源.成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体.免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上.[结论]本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	周泽扬	重庆师范大学动物生物学重点实验室	73	422	11.0	18.0
3	林立鹏	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	7	57	4.0	7.0
4	潘国庆	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	44	197	8.0	11.0
5	李田	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	26	114	6.0	10.0
6	李春峰	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	16	108	6.0	10.0
7	党晓群	重庆师范大学动物生物学重点实验室	11	21	3.0	4.0
8	龙梦娴	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	5	8	2.0	2.0