小鼠 LRRC 10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

• 作者: 吴秀山 周作琼 彭夕洋 彭浩 李佑锋 李永青 肖丽娜 范雄伟
• 来源期刊: 激光生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 腺病毒载体 Lrrc 1 0 心肌细胞
• 年，卷（期）: 2014,（3）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 246-250
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 3902字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2014.03.010

摘要

目的：构建含有小鼠Lrrc10（Leucine-rich Repeat Containing protein 10）基因的重组腺病毒表达载体。方法：设计小鼠Lrrc10特异性引物，以小鼠cDNA为模板，通过PCR扩增出mLrrc10的编码区，并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18 T载体。测序后，用Sal Ι和Hind III酶切，将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后，用100 ng转化细菌BJ5183，在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM2000转染293A细胞，包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后，反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞，绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果：用病毒液感染原代心肌细胞，24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光，提取心肌细胞总蛋白，Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论：小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功，并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。