摘要:
目的 探讨小鼠脂肪来源间充质干细胞培养上清液(ADSC-CM)对热损伤引起KC(人表皮细胞株HaCaT)凋亡的影响. 方法 (1)取5只健康BALB/c小鼠双侧腹股沟脂肪组织,采用胶原酶消化法分离纯化脂肪来源间充质干细胞(ADSC).取第3代细胞进行形态学观察,采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物C D31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达,并行成脂成骨诱导分化鉴定.(2)利用51.5℃水浴孵育HaCaT细胞35 s建立KC热损伤模型,流式细胞仪检测热损伤后即刻细胞凋亡率.(3)另取热损伤后HaCaT细胞按照随机数字表法分为常规培养组、无血清培养组、50% ADSC-CM组、100% ADSC-CM组,分别以含体积分数10% FBS的DMEM培养液、无血清的DMEM培养液、含体积分数50% ADSC-CM的DMEM培养液、体积分数100% ADSC-CM培养24 h.采用吖啶橙-溴化乙啶(AO-EB)染色法观察各组细胞的凋亡情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的mRNA和蛋白表达水平(蛋白表达结果以灰度值比值表示).流式细胞仪检测各组细胞周期分布.以上实验均重复测定3次.对数据行单因素方差分析和LSD-t检验. 结果 (1)分离培养的细胞形态规则,与Fb类似,CD31、CD34、CD45阳性表达率低于10.0%,CD90、CD105阳性表达率均高于90.0%,经诱导后可分化成脂肪细胞、骨细胞,鉴定为ADSC.(2)热损伤后即刻,HaCaT细胞的凋亡率为(9.8±0.4)%.(3)AO-EB染色结果显示,无血清培养组HaCaT细胞凋亡数量明显多于其他3组.无血清培养组细胞凋亡率为(8.1±1.2)%,明显高于50% ADSC-CM组的(6.0±0.8)%、常规培养组的(4.6±0.8)%和100% ADSC-CM组的(3.1±0.4)%(t值分别为3.02、4.96、6.60,P值均小于0.01);100% ADSC-CM组细胞凋亡率接近于常规培养组(t =1.50,P>0.05),而明显低于50%ADSC-CM组(t=10.21,P<0.01).(4)无血清培养组的Bcl-2 mRNA表达量为0.34±0.08,显著低于常规培养组的0.98 ±0.04、50% ADSC-CM组的0.77 ±0.05和100% ADSC-CM组的1.06 ±0.04(t值分别为12.87、8.07、14.11,P值均小于0.01);100% ADSC-CM组的Bcl-2 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.08,P>0.05),且明显高于50% ADSC-CM组(t=8.08,P<0.01).(5)无血清培养组的caspase-3 mRNA表达量为1.15±0.05,明显高于50% ADSC-CM组的0.72±0.11、常规培养组的0.41 ±0.03和100% ADSC-CM组的0.38 ±0.11(t值分别为6.93、13.97、22.79,P值均小于0.01);100% ADSC-CM组的caspase-3 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.05,P>0.05),但明显低于50% ADSC-CM组(t=4.77,P<0.01).(6)无血清培养组的Bcl-2蛋白表达量为0.93 ±0.04,显著低于常规培养组的1.74 ±0.06、50% ADSC-CM组的1.32 ±0.05和100% ADSC-CM组的1.90±0.04(t值分别为20.45、11.15、31.38,P值均小于0.01);100% ADSC-CM组的Bcl-2蛋白表达量接近于常规培养组(t=1.33,P>0.05),且明显高于50% ADSC-CM组(t=17.30,P<0.01).(7)无血清培养组的caspase-3蛋白表达量为0.63 ±0.08,明显高于50% ADSC-CM组的0.46 ±0.03、常规培养组的0.29 ±0.08和100% ADSC-CM组的0.21 ±0.03(t值分别为3.28、5.05、8.46,P值均小于0.01);100% ADSC-CM组的caspase-3蛋白表达量接近于常规培养组(t=0.08,P>0.05),但明显低于50% ADSC-CM组(t=3.52,P<0.05).(8)培养24 h,与无血清培养组比较,其他3组G2/M期细胞比例显著降低(t值分别为6.88、4.08、7.28,P<0.05或P<0.01);与无血清培养组比较,常规培养组、100% ADSC-CM组处于S期的细胞比例明显增加(t值分别为2.67、2.40,P值均小于0.05);各组G0/G1期细胞比例无明显变化(F=0.70,P>0.05). 结论 异种体积分数为100%的ADSC-CM可通过调节Bcl-2、caspase-3的表达来抑制热损伤引起的HaCaT细胞凋亡,缓解细胞G2/M期阻滞,加快细胞周期进程,推测异种或异体体积分数为100%的ADSC-CM在烧伤创面早期治疗方面有一定的应用潜力.