小鼠脂肪来源间充质干细胞培养上清液对热损伤引起的角质形成细胞凋亡的影响

• 作者: 方小兵 李娜 杨龙龙 王洪涛 白晓智 胡大海 贾文斌 陈冬冬 韩夫
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 间质干细胞 细胞凋亡 热损伤 角质形成细胞
• 年，卷（期）: 2014,（2）
• 所属期刊栏目: 创面修复的基础与临床研究
• 页码范围: 102-108
• 页数: 7页
• 字数: 5872字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2014.02.003

摘要

目的 探讨小鼠脂肪来源间充质干细胞培养上清液(ADSC-CM)对热损伤引起KC(人表皮细胞株HaCaT)凋亡的影响. 方法 (1)取5只健康BALB/c小鼠双侧腹股沟脂肪组织,采用胶原酶消化法分离纯化脂肪来源间充质干细胞(ADSC).取第3代细胞进行形态学观察,采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物C D31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达,并行成脂成骨诱导分化鉴定.(2)利用51.5℃水浴孵育HaCaT细胞35 s建立KC热损伤模型,流式细胞仪检测热损伤后即刻细胞凋亡率.(3)另取热损伤后HaCaT细胞按照随机数字表法分为常规培养组、无血清培养组、50％ ADSC-CM组、100％ ADSC-CM组,分别以含体积分数10％ FBS的DMEM培养液、无血清的DMEM培养液、含体积分数50％ ADSC-CM的DMEM培养液、体积分数100％ ADSC-CM培养24 h.采用吖啶橙-溴化乙啶(AO-EB)染色法观察各组细胞的凋亡情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的mRNA和蛋白表达水平(蛋白表达结果以灰度值比值表示).流式细胞仪检测各组细胞周期分布.以上实验均重复测定3次.对数据行单因素方差分析和LSD-t检验. 结果 (1)分离培养的细胞形态规则,与Fb类似,CD31、CD34、CD45阳性表达率低于10.0％,CD90、CD105阳性表达率均高于90.0％,经诱导后可分化成脂肪细胞、骨细胞,鉴定为ADSC.(2)热损伤后即刻,HaCaT细胞的凋亡率为(9.8±0.4)％.(3)AO-EB染色结果显示,无血清培养组HaCaT细胞凋亡数量明显多于其他3组.无血清培养组细胞凋亡率为(8.1±1.2)％,明显高于50％ ADSC-CM组的(6.0±0.8)％、常规培养组的(4.6±0.8)％和100％ ADSC-CM组的(3.1±0.4)％(t值分别为3.02、4.96、6.60,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组细胞凋亡率接近于常规培养组(t =1.50,P＞0.05),而明显低于50％ADSC-CM组(t=10.21,P＜0.01).(4)无血清培养组的Bcl-2 mRNA表达量为0.34±0.08,显著低于常规培养组的0.98 ±0.04、50％ ADSC-CM组的0.77 ±0.05和100％ ADSC-CM组的1.06 ±0.04(t值分别为12.87、8.07、14.11,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的Bcl-2 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.08,P＞0.05),且明显高于50％ ADSC-CM组(t=8.08,P＜0.01).(5)无血清培养组的caspase-3 mRNA表达量为1.15±0.05,明显高于50％ ADSC-CM组的0.72±0.11、常规培养组的0.41 ±0.03和100％ ADSC-CM组的0.38 ±0.11(t值分别为6.93、13.97、22.79,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的caspase-3 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.05,P＞0.05),但明显低于50％ ADSC-CM组(t=4.77,P＜0.01).(6)无血清培养组的Bcl-2蛋白表达量为0.93 ±0.04,显著低于常规培养组的1.74 ±0.06、50％ ADSC-CM组的1.32 ±0.05和100％ ADSC-CM组的1.90±0.04(t值分别为20.45、11.15、31.38,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的Bcl-2蛋白表达量接近于常规培养组(t=1.33,P＞0.05),且明显高于50％ ADSC-CM组(t=17.30,P＜0.01).(7)无血清培养组的caspase-3蛋白表达量为0.63 ±0.08,明显高于50％ ADSC-CM组的0.46 ±0.03、常规培养组的0.29 ±0.08和100％ ADSC-CM组的0.21 ±0.03(t值分别为3.28、5.05、8.46,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的caspase-3蛋白表达量接近于常规培养组(t=0.08,P＞0.05),但明显低于50％ ADSC-CM组(t=3.52,P＜0.05).(8)培养24 h,与无血清培养组比较,其他3组G2/M期细胞比例显著降低(t值分别为6.88、4.08、7.28,P＜0.05或P＜0.01);与无血清培养组比较,常规培养组、100％ ADSC-CM组处于S期的细胞比例明显增加(t值分别为2.67、2.40,P值均小于0.05);各组G0/G1期细胞比例无明显变化(F=0.70,P＞0.05). 结论 异种体积分数为100％的ADSC-CM可通过调节Bcl-2、caspase-3的表达来抑制热损伤引起的HaCaT细胞凋亡,缓解细胞G2/M期阻滞,加快细胞周期进程,推测异种或异体体积分数为100％的ADSC-CM在烧伤创面早期治疗方面有一定的应用潜力.