人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

• 作者: 冀全博 冯滢滢 叶棋浓 周丽英 徐小洁 李玲 杜楠 王涛 黄蓉
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: GST-14-3-3σ融合蛋白 原核表达 纯化
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 488-491
• 页数: 4页
• 分类号: Q78
• 字数: 3464字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2014.04.008

摘要

目的：构建人14-3-3σ基因的原核表达载体，获得其原核表达产物，并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法：采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列，将其克隆到pGEX-KG载体中，重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白，利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化，并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达，采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果：从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段，并成功克隆至pGEX-KG载体上，经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段，测序与目的基因序列完全一致；在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52000的目的蛋白，SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功，并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白；通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合，并证实其具有生物学活性。结论：获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白，为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。