腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定

• 作者: 冯学泉 刘俊 刘宏胜 刘家美 吴静超 张飚 徐新女 王金环
• 来源期刊: 肿瘤防治研究
• 学科: 医学
• 关键词: 碱性成纤维细胞生长因子 腺病毒 载体 小分子干扰RNA
• 年，卷（期）: 2014,（11）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1186-1189
• 分类号: R73-3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2014.11.006

摘要

目的 构建一种高效“沉默”碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料.方法 设计、合成优选的靶向bFGF特异性sjRNA序列.采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA.鉴定正确后经PacⅠ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAdS-bFGF-siRNA.同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果.结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90％.结论 应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础.