血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

• 作者: 丁孝茹 刘晓玲 方颖 王依璐
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织工程 血管性血友病因子A1 血管性血友病因子G1324S 血小板 原核表达 可溶性 亲和层析 流动腔 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2014,（38）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建基础实验
• 页码范围: 6153-6159
• 页数: 7页
• 分类号: R318
• 字数: 8025字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.015

摘要

背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用，但重组A1在原核中多为包涵体表达，不利于纯化及体外的功能研究。 <br>　　目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S，并研究其生物学功能。 <br>　　方法：将血管性血友病因子A1(野生型)、血管性血友病因子G1324S(功能失去型突变体)重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中，筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌(E.coli)BL21、E.coli M15中，筛选挑单克隆菌于LB培养基，扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法，使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达，经过Ni柱亲和层析纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性；采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下，血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。 <br>　　结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1，6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品，并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示，对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较，随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa，G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度(46.8%)要远高于野生型组(20.5%)，说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致，野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	方颖	华南理工大学生物科学与工程学院	25	53	4.0	6.0
2	王依璐	华南理工大学生物科学与工程学院	1	4	1.0	1.0
3	刘晓玲	华南理工大学生物科学与工程学院	3	14	3.0	3.0
4	丁孝茹	华南理工大学生物科学与工程学院	2	8	2.0	2.0