人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

• 作者: 丰慧根 原志庆 李卫东 林俊堂 栗炳南
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织工程 白血病抑制因子 血管内皮生长因子165 真核双表达载体 内部核糖体进入位点 转染 双PCR
• 年，卷（期）: 2014,（24）
• 所属期刊栏目: 组织构建与生物活性因子
• 页码范围: 3870-3877
• 页数: 8页
• 分类号: R318
• 字数: 7844字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.017

摘要

背景:人向血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标:构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法:是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论:DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	丰慧根	新乡医学院生命科学技术学院	75	167	6.0	8.0
2	原志庆	新乡医学院生命科学技术学院	27	74	5.0	7.0
3	林俊堂	新乡医学院生命科学技术学院	61	101	5.0	6.0
4	李卫东	新乡医学院生命科学技术学院	7	2	1.0	1.0
5	栗炳南	新乡医学院生命科学技术学院	4	1	1.0	1.0