构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测

• 作者: 曾维政 杜超 蒋明德 郑淑梅
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 实验动物 组织工程 人基质金属蛋白酶1基因 Gateway技术 重组腺病毒载体 Ⅲ型胶原
• 年，卷（期）: 2014,（49）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 基因病毒载体及相关因子与动物模型
• 页码范围: 7995-8000
• 页数: 6页
• 分类号: R318
• 字数: 6896字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.022

摘要

背景：基质金属蛋白酶1能够降解以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质，有望逆转纤维化组织。目的：利用Gateway技术构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体，并观察其在体外降解Ⅲ型胶原蛋白的能力。方法：从携带人基质金属蛋白酶1基因片段的pcDNA3.1质粒中PCR扩增出人基质金属蛋白酶1基因片段，双酶切连接入门载体pENTERTM 1A形成入门克隆，利用LR反应与目的载体pJTITM R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector同源重组构建表达克隆pAd- hMMP-1-eGFP。经PacⅠ酶切线性化转入HEK293A细胞包装获得重组腺病毒 Ad-hMMP-1-eGFP，RT-PCR 及 Western-Blot 法分别检测目的基因与蛋白表达。细胞分为3组：①空白对照组：HEK293A细胞。②AD-EGFP组：Ad-eGFP感染HEK293空白对照组。③AD-HMMP1-EGFP组：Ad-hMMP-1-eGFP感染HEK293空白对照组。分别加入相同含量Ⅲ型胶原蛋白，在24，48，72 h用ELISA试剂盒检测Ⅲ型胶原蛋白水平。结果与结论：经酶切及测序鉴定证实入门载体和目的载体中均含有人基质金属蛋白酶1目的基因。重组腺病毒Ad- hMMP-1-eGFP感染293A细胞后4 d观察到绿色荧光表达，10 d荧光强度达最高，12d收集病毒液；测定病毒滴度为4.84×1010 PFU/mL，Western-Blot法检测目的蛋白高效表达。随时间延长，空白对照组和AD-EGFP组胶原蛋白含量无明显变化，AD-HMMP1-EGFP组24，48，72 h胶原蛋白降解率分别为24%，56%，81%，与空白对照组、AD-EGFP组相比AD-HMMP1-EGFP组降解胶原效果显著(P <0.01)。利用Gateway技术成功构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体，与传统构建方法相比具有高效性和特异性，分泌基质金属蛋白酶1检测其降解Ⅲ型胶原蛋白效果显著。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	曾维政	解放军成都军区总医院消化内科	6	66	5.0	6.0
2	蒋明德	解放军成都军区总医院消化内科	8	79	6.0	8.0
3	郑淑梅	解放军成都军区总医院消化内科	2	7	1.0	2.0
4	杜超	解放军成都军区总医院消化内科	2	9	1.0	2.0