[目的]建立冬虫夏草HPLC指纹图谱,为其真伪鉴别提供有效方法,并定量测定其6种共有核苷类成分(尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素)的质量。[方法]采用HPLC,色谱柱Waters Symmetry RP-C18(250×4.6 mm,5μm),以乙酸缓冲盐(p H 6.5,A)-甲醇(B)为流动相,梯度洗脱,检测波长260 nm,柱温25℃,流速0.8 m L/min。应用中药色谱指纹图谱相似度计算软件对指纹图谱进行相似度评价、聚类分析。[结果]所建立的方法重复性和精密度良好,建立的冬虫夏草指纹图谱包含24个共有峰,各峰分离良好,确认出尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素6个共有成分。考察了29批西藏冬虫夏草,3批西藏以外地区冬虫夏草,2批蛹虫草,1批假虫草的指纹图谱与冬虫夏草指纹对照图谱的相似度。通过相似度分析,能很好的区分冬虫夏草、蛹虫草和假虫草。[结论]所建立的方法简单可靠,可做为冬虫夏草真伪鉴定的有效实验方法和依据。