羟喜树碱通过蛋白激酶R样内质网激酶途径促进人Tenon囊成纤维细胞自噬作用

• 作者: 傅煜轩 范舒欣 袁志兰
• 来源期刊: 中华实验眼科杂志
• 关键词: 自噬 羟喜树碱 内质网应激 信号转导 人 Tenon囊 成纤维细胞 基因转染 基因敲除
• 年，卷（期）: 2015,（3）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 201-206
• 页数: 6页
• 字数: 5272字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2015.03.003

摘要

背景 研究证实,羟喜树碱可通过蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)途径引起人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)凋亡,细胞自噬与凋亡均为细胞在外界压力下产生的程序性死亡反应,二者关系密切,但羟喜树碱与HTFs自噬之间的关系尚不明确. 目的 探讨羟喜树碱对HTFs自噬的作用及其机制.方法 从健康成年眼球供体中取人Tenon囊组织,经组织块培养法培养细胞,并用免疫组织化学法检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定培养的细胞.利用293T细胞包装pLVX-PERK慢病毒,将慢病毒转染入HTFs,通过嘌呤霉素筛选出稳定的PERK敲除细胞系.用质量浓度为0.10 g/L的羟喜树碱处理细胞5 min后继续培养24h作为实验组,未用羟喜树碱处理的细胞作为对照组.采用Western blot法检测各组HTFs中自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关基因5(ATG-5)、微管相关蛋白1轻链3(LC-3)表达的灰度值;采用Cyto-ID荧光染色法检测各组HTFs中自噬小体的荧光强度及数量,将各实验结果进行分析比较. 结果 0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白表达的灰度值分别为0.980±0.070、1.495±0.095、0.585±0.025和0.785±0.055,明显高于对照组的0.365 ±0.045、0.765 ±0.055、0.120±0.030和0.215±0.035,差异均有统计学意义(Beclin-1:P=0.018;ATG-5:P=0.022;LC-3-Ⅰ:P=0.007;LC-3-Ⅱ:P=0.013).荧光显微镜检测发现,羟喜树碱处理组中自噬小体的绿色荧光强于对照组.Western blot检测结果显示,PERK敲除的细胞中PERK蛋白灰度值为0.130±0.030,明显低于对照组的0.765 ±0.055,差异有统计学意义(P=0.010),而2个组间细胞中Beclin-1、ATG-5和LC-3蛋白反应条带强度无明显差别.0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中PERK蛋白表达的灰度值为1.790±0.060,较对照组的0.880±0.070明显升高,差异有统计学意义(P=0.010).PERK敲除±0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白表达的灰度值分别为0.475 ±0.045、0.390±0.040、0.055±0.015和0.075±0.025,明显低于对照±0.10 g/L羟喜树碱处理组的0.955±0.065、0.765±0.055、0.155±0.015和0.280±0.030,差异均有统计学意义(Beclin-1:P=0.026;ATG-5:P=0.031;LC-3-Ⅰ:P=0.042;LC-3-Ⅱ:P=0.034).PERK敲除+0.10 g/L羟喜树碱处理组细胞中自噬小体的绿色荧光强度明显低于对照+0.10 g/L羟喜树碱处理组. 结论 羟喜树碱可能通过PERK途径诱导HTFs的自噬.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	袁志兰	南京医科大学第一附属医院眼科	73	292	8.0	12.0
2	范舒欣	南京医科大学第一附属医院眼科	2	10	2.0	2.0