罗非鱼HSP70(tHSP70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

• 作者: 张瑶瑶 李旻 梁万文 甘西 罗洪林 陈福艳
• 来源期刊: 水产学报
• 学科: 农学
• 关键词: 罗非鱼热休克蛋白70 真核表达 糖基化 质谱鉴定
• 年，卷（期）: 2015,（5）
• 页码范围: 618-627
• 分类号: Q785|S965
• 语种: 中文
• DOI: 10.11964/jfc.20141009533

摘要

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70 (tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni2+IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定.对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类.结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49.在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58.可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带.经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白.本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	梁万文		36	392	11.0	18.0
2	甘西		52	550	13.0	22.0
3	陈福艳		31	139	6.0	11.0
4	李旻		6	8	2.0	2.0
5	罗洪林		8	10	2.0	2.0
6	张瑶瑶	广西大学动物科学技术学院	2	9	2.0	2.0