重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析

• 作者: 平宪卿 张一唯 曹荣月 杨敏 黄潇 龙军
• 来源期刊: 药物生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 胰蛋白酶突变体 蛋白表达 包涵体 蛋白复性 胰岛素 离子交换层析
• 年，卷（期）: 2015,（4）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 283-287
• 页数: 5页
• 分类号: Q55|Q784
• 语种: 中文

摘要

胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键.胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物.所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值.以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(TgM)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体.将TgM基因插入到表达载体pET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒pET28a-TgM并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含TgM基因的工程菌株并诱导表达.14％ SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在.包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化.纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/mL,比活力为1 566.27 U/mg.将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少.