用于四种主要作物转基因筛查检测的标准质粒分子的构建及应用

• 作者: 彭城 徐俊锋 徐晓丽 朱青 汪小福 缪青梅 陈笑芸
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 转基因生物(GMOs) 标准质粒 筛选检测 试用性
• 年，卷（期）: 2015,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1167-1177
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.09.006

摘要

标准质粒分子能够及时满足转基因生物安全监管需求,被较多地用作转基因标准材料的替代品.本研究通过分析全球商业化种植和国内环境释放的水稻(Oryza sativa L.)、玉米(Zea mays L.)、大豆(Glycine max)和油菜(Brassica napus)4种主要转基因作物的分子特征,选取常用的扩增性较好的蔗糖磷酸合酶基因(sucrose phosphate synthase,SPS)作为内标准基因和外源花椰菜花叶病毒35S启动子(promoter of Cauliflower mosaicvirus 35S,CaMV35S)、胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,tNOS)、苏云金芽胞杆菌基因(Bacillus thuringiensis,Bt)、双丙氨酰磷抗性基因(biolaphos resistance, Bar)、新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase,NPTⅡ)和潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,Hpt)作为水稻转基因筛查靶标序列;选取淀粉合成酶基因(zSSⅡb)作为内标准基因和外源CaMV35S、tNOS、Bar作为玉米转基因筛查靶标序列;选取凝集素前体蛋白基因(Lectin)作为内标准基因和外源CaMV35S、tNOS、胰蛋白酶抑制剂基因(cowpea trypsin inhibitor gene,CpTi)、烯醇式丙酮基莽草酸磷酸合成酶基因(enolpyruvylshikimate phosphate synthase,EPSPS)作为大豆转基因筛查靶标序列;选取高移动簇蛋白基因(high mobile group protein,HMG)作为内标准基因和外源CaMV35S、玄参花叶病毒35S启动子(Figwort mosaicvirus 35S,FMV35S)、烟草绒毡层特异启动子(tobaccotapetum specific promoter,PTa29)、胭脂碱合酶启动子(nopaline synthase promoter,P-nos)、tNOS、35S终止子(terminator-35S,T-35S)、TL-DNA基因7(g7)终止子作为油菜转基因筛查检测的目标序列.利用重叠PCR技术将这些筛查目标序列连接在一起,最终克隆到pMD-18T载体上,构建成4套共包含4个内标准基因和13个转基因外源基因的通用阳性质粒分子:pMD-maize、pMD-rape、pMD-rice和pMD-soybean.研究结果表明,所构建的阳性质粒分子对目前国内外4类(大豆、油菜、玉米和水稻)主要转基因作物筛查覆盖率理论上达到90％,而对我国批准进口的转基因作物的理论筛查覆盖率达100％.可满足转基因生物安全监管检测过程中对阳性物质的需求.