应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定

• 作者: 印翠 孙文慧 孙近近 张俊玲 施志仪
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: 牙鲆 miRNA emx2 定点诱变 psiCHECK-emx2-3'UTR psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR
• 年，卷（期）: 2015,（12）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 180-185
• 页数: 6页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.026

摘要

以牙鲆空通气孔同源框2基因（empty spiracles homeobox 2，emx2）为例，构建包含emx23'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体，以期应用于miRNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA，参照已克隆出来的emx2基因cDNA序列，设计并合成emx23'UTR片段的引物并进行 PCR扩增，将得到的基因片段和 psiCHECK-2载体双酶切后，用T4 DNA Ligase酶进行连接反应，并转化入 DH5α感受态细胞，筛选后得到野生型重组质粒；同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx23'UTR区，并将emx23'UTR区的miRNA靶点序列GACTTGA突变为 AGTCCAG，成功构建了野生型和突变型包含emx23'UTR区的miRNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于miRNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3'UTR和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	施志仪	上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水水产种质资源重点实验室	48	217	9.0	11.0
2	张俊玲	上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水水产种质资源重点实验室	19	79	5.0	8.0
3	孙近近	上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水水产种质资源重点实验室	3	10	2.0	3.0
4	孙文慧	上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水水产种质资源重点实验室	3	10	2.0	3.0
5	印翠	上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水水产种质资源重点实验室	1	5	1.0	1.0