猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a 和3b 融合表达及对细胞周期的影响

• 作者: 常嵘 张琪 梁亚冰 童德文 许信刚
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 非结构蛋白3a 非结构蛋白3b 真核表达 细胞周期
• 年，卷（期）: 2015,（2）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 352-361
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.15

摘要

【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ，TGEV）陕西分离株的3a 和3b 基因，研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件 Primer 5.0参照 Genbank 公布的序列设计两对分别针对 TGEV 非结构蛋白基因3a 和3b 的特异性引物。采用 RT-PCR 方法从 TGEV陕西分离株克隆3a 和3b 基因，再将其与真核表达载体 pEGFP-N1连接，构建真核表达质粒 p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells，IEC），采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过 RT-PCR 检测细胞中目的基因的转录情况，Western blotting 检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响，采用实时荧光定量 PCR 检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子 GRP78和细胞周期蛋白 Cyclin A 的表达的影响，通过 Western blotting 试验检测细胞中蛋白表达后 GRP78、Cyclin A 和 Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的 TGEV 陕西分离株的3a 及3b 基因，经过测序鉴定，3a 基因的大小为213bp，3b 基因的大小为732bp；经过与不同来源的 TGEV 毒株进行对比分析，3a 基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%—100%，氨基酸同源性为98.6%—100%；3b 基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%—99.9%，氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染 IEC 细胞后，经 Western blotting 分析 IEC 分别表达出分子质量约为35kD 的3a-GFP和54kD 的3b-GFP 的融合蛋白，与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP 和3b-GFP 在 IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达，流式细胞仪分析 TGEV 非结构蛋白3b 的表达能够使 G2/M 期的细胞增多，实时荧光定量 PCR 分析显示细胞周期蛋白 Cyclin A 的 mRNA 水平高于对照组细胞（IEC 和 IEC-GFP），同时 Western blotting 分析结果显示表达3b 蛋白的细胞中 Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组，并且 Cyclin B1的表达量低于对照组细胞，差异显著；TGEV 非结构蛋白3a 对细胞周期没有影响。实时荧光定量 PCR 分析结果显示，表达 TGEV 非结构蛋白3a 的细胞中 GRP78的 mRNA 水平高于对照组， Western blotting 分析 GRP78的蛋白水平高于对照组，差异显著，说明非结构蛋白3a 可以使 GRP78表达水平的上调；TGEV 非结构蛋白3b 对 GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV 陕西株的非结构蛋白3a 和3b 在 IEC 细胞中成功表达，3a 蛋白可以引起细胞内质网应激反应，3b 蛋白通过使细胞周期蛋白 Cyclin A 表达上调并且使 Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于 G2/M 期。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	童德文	西北农林科技大学动物医学院	91	938	15.0	27.0
2	许信刚	西北农林科技大学动物医学院	116	501	10.0	14.0
3	张琪	西北农林科技大学动物医学院	75	218	9.0	11.0
4	常嵘	西北农林科技大学动物医学院	2	3	1.0	1.0
5	梁亚冰	西北农林科技大学动物医学院	1	3	1.0	1.0